Cytometry vystavují jednotlivé buňky laserovému světlu, aby se vytvořily rozptýlené a fluorescenční světelné paprsky. Rychlé a přesné zachycení výsledného světla a jeho převod na digitální signály vyžaduje lavinovou fotodiodu (APD) a složitou elektroniku. Návrh obvodů není jednoduchý proces, jelikož systémy pro sběr dat průtokové cytometrie vyžadují vysokorychlostní přenos dat s nízkým šumem, aby byla zajištěna přesnost celého systému.
Tento článek stručně představí systémy průtokové cytometrie, a to ADAQ23878 od Analog Devices a 18bitový modul ADC, a jak je použít k návrhu stupně detekce a konverze průtokového cytometru. Nakonec si představíme vývojovou sadu pro pochopení celého návrhu.
Moderní principy průtokové cytometrie
Moderní průtoková cytometrie je automatizovaný proces, který analyzuje buněčné a povrchové molekuly, charakterizuje a definuje různé typy buněk v heterogenní buněčné populaci. Nepočítáme-li dobu přípravy, která může trvat více než hodinu, přístroj provede tří až šest charakteristických měření na každé buňce z celkového počtu 10 000 buněk za méně než minutu.
Kritická je příprava jedné buňky pro průtokovou cytometrii. Buňky nebo částice se musí seřadit do úzkého proudu jednobuněčné linie. Toho se docílí pomocí hydromechaniky v tekutině. Při této transformaci si jednotlivé buňky musí zachovat své přirozené biologické vlastnosti a biochemické složky.
Obrázek 1: Schéma průtokového cytometru od zaměření po sběr dat. (Zdroj obrázku: Wikipedie, upravila Bonnie Baker)
Šest hlavních součástí průtokového cytometru jsou: průtoková komora, laser, lavinová fotodioda (APD), transimpedanční zesilovač (TIA), ADC převodník a počítač pro sběr a analýzu dat. Laserové světlo zachycuje jednu buňku po druhé a vytváří paprsek dopředně rozptýleného světla (FSC) a paprsek bočního rozptýleného světla (SSC). Fluorescenční světlo je tříděno pomocí zrcadel a filtrů a poté zesíleno lavinovou diodou APD.
Dalším krokem je detekce, digitalizace a analýza výsledného světelného výstupu poté, co dopadne na lavinovou diodu. Pro detekci je ideální vstupní 500 MHz operační zesilovač LTC6268 s ultra nízkým předpětím a nízkonapěťovým šumem FET pro vysokorychlostní zesilovač TIA.
Obrázek 2: Obvod TIA používá APD (PD1 ) a operační zesilovač FET s nízkým vstupním proudem k převodu velmi malých proudů fotodiody na výstupní napětí na IN1+. (Zdroj obrázku: Bonnie Baker)
Je nezbytné, aby tento obvod zesilovače měl co největší šířku pásma, takže parazitní kapacity musí být co nejvíce minimalizovány. Například parazitní zpětná kapacita C ovlivňuje stabilitu obvodu a šířku pásma na obrázku 2. Bez ohledu na volbu pouzdra rezistoru bude ve zpětné vazbě zesilovače vždy existovat parazitní kapacita. Pro vysokorychlostní aplikace je však vhodnější pouzdro 0805, které má delší vzdálenost mezi koncovkami a nejnižší parazitní kapacitu. Zvětšení vzdálenosti mezi koncovými body R1 není jediný způsob, jak snížit kapacitu. Dalším způsobem, jak snížit kapacitu mezi deskami, je odstínit cesty pole E, které vedou ke vzniku parazitní kapacity, umístěním další zemní stopy pod rezistor R1 (obrázek 3).
Obrázek 3: Přidání zemní stopy pod zpětnovazební rezistor odkloní pole E od strany zpětné vazby a svede je na zem. (Zdroj obrázku: Analog Devices)
Tato technika poskytuje hodnotu parazitní kapacity 0,028 pF se šířkou pásma TIA 1/(2π*RF*C PARASITIC), rovnající se 11,4 MHz. Optické světelné signály směřují k několika lavinovým diodám s příslušnými optickými filtry. Systémy APD, TIA a ADC převádějí tyto signály na jejich digitální reprezentaci a odesílají data do mikroprocesoru k další analýze.
Moderní přístroje mají obvykle více laserů a tunelových diod APD. Současná zařízení obvykle obsahují deset laserů a třicet lavinových fotodiod. Zvýšení počtu laserů a fotodiod umožňuje vícenásobné značení protilátek pro přesnou identifikaci pomocí fenotypových markerů. Rychlost analýzy však závisí na jemné rovnováze:
- Rychlosti tekutiny
- Schopnosti procesu hydrodynamického fokusu tvořit jednobuněčné linie
- Průměru tunelu
- Schopnosti zachovat integritu buňky
- Elektroniky
Průtoková cytometrie pomocí akustiky
Přidání více laserů a tunelových diod APD urychluje analýzu a identifikaci. V nejlepším případě mohou nejnovější moderní jednobuněčné průtokové cytometrické metody sbírat data až o jednom milionu buněk za minutu. V mnoha aplikacích, jako je detekce cirkulujících nádorových buněk přítomných v krvi v hladinách pouhých 100 buněk na mililitr, je to nedostatečné. V klinických aplikacích se vzácnými buňkami testy pravidelně vyžadují časově náročnou analýzu miliard buněk.
Alternativou k hydrodynamickému procesu je proces akustické fokusace. Zde je piezoelektrický materiál - olovnatý zirkoničitan titaničitý (PZT) připojen ke skleněné kapiláře, aby přeměnil elektrické impulsy na mechanické vibrace (obrázek 4a). Použitím PZT k vibraci bočních stěn skleněné kapiláry na rezonanční frekvenci obdélníkového průtokového článku systém generuje různé akustické stojaté vlny s různým počtem tlakových uzlů.
Obrázek 4: Akustické průtokové komory vyrobené s pravoúhlou skleněnou kapilárou (a). Umístění prvních tří tlakových uzlů pro kapiláru s pevnou šířkou (b). (Zdroj obrázku: Národní centrum pro biotechnologické informace)
Tyto frekvenční uzly zarovnávají proudící částice do více samostatných proudnic (obrázek 4b). Akustická průtoková buňka používá lineární stojatou akustickou vlnu k naladění na různé vlnové délky vytvořením jedné nebo více harmonických. Díky této přesné organizaci buněk se šířka tunelu průtokového pouzdra může rozšířit, aby umožnila rychlejší průtoky kolem laserového paprsku (obrázek 5).
Obrázek 5: S hydrodynamickým proudem vzorku (c. a d.) se při zvětšování šířky pouzdra buňky rozptylují, a to ztěžuje proces optického měření. Akusticky zaměřené proudy vzorků (a. a b.) udržují buňky v jednom souboru bez ohledu na šířku hrdla. (Zdroj obrázku: Thermo Fischer Scientific)
Tradiční hydrodynamická fokusace (obrázek 5c.) uspořádá jednobuněčné linie při přípravě na laserové skenování. Širší trychtýř proudu umožňuje vyšší rychlost (obrázek 5d.), ale má také za následek rozšíření, a to vede ke změnám signálu a zhoršené kvalitě dat. Akustická fokusace (obrázek 5a.) umístí biologické buňky a další částice do těsného zarovnání, dokonce i se širším hrdlem. Toto přesné zarovnání buněk umožňuje vyšší vzorkovací frekvenci při zachování kvality dat (obrázek 5b.). V praxi akustická fokusace průtokové cytometrie zvyšuje frekvenci vzorkování buněk přibližně 20x (obrázek 6).
Obrázek 6: Porovnání doby odběru vzorků pro různé metody průtokové cytometrii. Hydrodynamická (A, B, C) versus akustická fokusační cytometrie (D). (Zdroj obrázku: Thermo Fischer Scientific)
Akustická průtoková cytometrie - získávání dat
Konstrukce elektroniky pro průtokovou cytometrii s akustickou fokusací vyžaduje vysokorychlostní fotocitlivou elektroniku, aby se přizpůsobila rychlosti krevních buněk a tekutiny skrz trysku s větším průměrem. Výše zmíněný vysokorychlostní 600 MHz LTC6268 v kombinaci se rezistorem 0805 přináší rychlost optického snímání až 11,4 MHz (obrázek 7, vlevo). Výstup LTC6268 je přiváděn do ADAQ23878 ADC převodníku.
Obrázek 7: ADAQ23878 ADC digitalizuje optický signál z fotodiody (PD1 ) a obvodu TIA (vlevo). (Zdroj obrázku: Bonnie Baker)
18ti bitový převodník ADAQ23878 dokáže zpracovávat 15 miliónů vzorků za sekundu (MSPS). Jedná se o přesné, vysokorychlostní řešení pro sběr dat SIP (system-in-package). Tento převodník výrazně snižuje dobu vývoje měřících systémů obecně. Modulární převodník SIP výrazně snižuje počet obvodů na desce, jelikož obsahuje několik bloků pro zpracování a úpravu signálu v jediném pouzdře. Tyto bloky zahrnují nízkošumový, plně diferenciální zesilovač ADC a stabilní referenční vyrovnávací paměť.
ADAQ23878 také obsahuje všechny důležité pasivní komponenty, které využívají technologii Analog Devices iPassive, a díky tomu dochází k minimalizaci zdrojů chyb závislých na teplotě a optimalizaci výkonu.
Vývojová deska pro ADAQ23878
Analog Devices poskytuje vývojovou desku EVAL-ADAQ23878FMCZ (obrázek 8). Na desce si lze vyzkoušet výkon μModule ADAQ23878. Díky vysokému výkonu je modul vhodný pro průtokovou cytometrii a řady dalších aplikací.
Obrázek 8: Vývojová deska EVAL-ADAQ23878FMCZ pro ADAQ23878 obsahuje napájecí obvody a je dodávána s přidruženým softwarem pro řízení a analýzu dat a je kompatibilní s SDP-H1. (Zdroj obrázku: Analog Devices)
Vývojová deska EVAL-ADAQ23878FMCZ vyžaduje osobní počítač se systémem Windows 10 nebo vyšším, nízkošumový, přesný zdroj signálu a pásmovou propust vhodnou pro 18bitové testování. Vývojová deska potřebuje plugin ADAQ23878 ACE a ovladač SPD-H1.
Závěr
Vyšetření jedné biologické buňky pomocí standardních technik hydrodynamické fokusové průtokové cytometrie byl časově náročný proces. Bylo potřeba tento proces zrychlit a tak došlo k posunu k rychlejší akustické fokusové průtokové metody. Vysokorychlostní operační zesilovač LTC6268 a přesné, vysokorychlostní řešení μModule ADAQ233878 nám pomůže vytvořit kompletní systém pro sběr dat, který se uplatní i v tak náročné aplikaci jako je průtoková cytometrie.
Článek vyšel v originále na webu DigiKey.com, autorem je Bonnie Baker.
